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單細(xì)胞測序

一.服務(wù)內(nèi)容


我公司提供的單細(xì)胞建庫測序技術(shù)服務(wù)是針對大規(guī)模細(xì)胞群體進(jìn)行表達(dá)譜分析,具體服務(wù)內(nèi)容是利用10x Genomics微流控凝膠微珠技術(shù)對細(xì)胞懸液樣本中的500~10,000個單細(xì)胞進(jìn)行捕獲標(biāo)記,同時對每個標(biāo)記了的細(xì)胞中的RNA分子進(jìn)行獨立標(biāo)記,建成用于illumina測序平臺的轉(zhuǎn)錄組測序文庫。建成的文庫將在illumina NGS測序平臺上進(jìn)行測序。最終利用10x Genomics的Cell Ranger對測序的結(jié)果進(jìn)行解碼,并針對單個細(xì)胞的表達(dá)譜差異對樣本細(xì)胞群進(jìn)行細(xì)胞亞群分析。

 

二.實驗操作步驟概述


1. 對單細(xì)胞懸浮液樣本進(jìn)行10x Genomics上機(jī),制備油包水微滴乳濁液(GEMS)。

2. 油包水微滴乳濁液上PCR儀,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄操作。

3. 破乳后進(jìn)行cDNA的回收、純化和擴(kuò)增等操作。

4. 進(jìn)行片段化,末端修復(fù),加A、加接頭,Sample Index PCR等后續(xù)文庫構(gòu)建操作。

 

三.實驗結(jié)果


我公司完成10x Genomics建庫技術(shù)服務(wù)的過程中提供2個結(jié)果,分別是文庫質(zhì)檢結(jié)果報告和測序結(jié)果分析報告。

 

四.樣品要求及注意事項


1. 接收的樣品為單細(xì)胞懸液,如需組織解離,細(xì)胞分選等樣品制備需由客戶自行完成。

2. 單細(xì)胞懸液中,細(xì)胞間無粘連,無大于40uM的細(xì)胞碎片或其他顆粒物),單細(xì)胞懸液上樣前需過40uM細(xì)胞濾網(wǎng)(如Falcon cell strainer, REF 352340),確保不會堵塞微流控通道。

3. 細(xì)胞懸液中單細(xì)胞個數(shù)應(yīng)大于預(yù)期實測細(xì)胞個數(shù)的2倍,如預(yù)期測到500個單細(xì)胞的數(shù)據(jù),應(yīng)提供至少1000個單細(xì)胞。

4. 細(xì)胞成活率應(yīng)大于85%(用臺盼藍(lán)染色檢測)。

5. 上機(jī)單細(xì)胞懸液體積應(yīng)小于30ul,建議細(xì)胞懸液濃度大約為1000個細(xì)胞/ul。

6. 如一次性上機(jī)多個樣品,第一個樣品制備完成到最后一個樣品制備完成時間相差不超過1個小時。

 

五.服務(wù)驗收標(biāo)準(zhǔn)


在細(xì)胞樣品達(dá)到上述要求的前提下,結(jié)果達(dá)到如下標(biāo)準(zhǔn):

1.測序文庫合格:文庫檢測為單峰,且濃度高于3nM,體積大于25ul。

2.細(xì)胞捕獲效率達(dá)到50%:最終測序數(shù)據(jù)結(jié)果中的細(xì)胞數(shù)達(dá)到50%的起始細(xì)胞數(shù)。

 

六.服務(wù)承諾


1. 對于達(dá)到樣本要求的實驗,由于細(xì)胞計數(shù)誤差等實驗中存在的不確定性,實驗結(jié)果在上述標(biāo)準(zhǔn)的±20%以內(nèi)都為可以接受的范圍。如果結(jié)果在驗收標(biāo)準(zhǔn)20%以下的(即捕獲效率低于40%)可判定實驗失敗,公司將承擔(dān)該樣本的試劑耗材及服務(wù)費等全部費用。

2. 如果實驗過程中確認(rèn)試劑耗材質(zhì)量的問題,我公司負(fù)責(zé)向10x Genomics廠家申請賠付。(通過其它渠道采購的試劑耗材,我們也將協(xié)助客戶完成索賠)

3. 如果細(xì)胞樣品未達(dá)到要求,客戶可以選擇重新送樣或風(fēng)險上機(jī),風(fēng)險上機(jī)將不能按照上述標(biāo)準(zhǔn)驗收。

 

七.常見問題解答


1. 10x Genomics廠家的捕獲成功標(biāo)準(zhǔn)是65%,為什么貴公司承諾只有50%?

答:廠家測試捕獲效率用的是細(xì)胞系,細(xì)胞系樣品很容易制備成單細(xì)胞懸液,且能保證較高的細(xì)胞活性和完整性,而服務(wù)項目客戶很少用細(xì)胞系,大部分是用組織解離制備的細(xì)胞懸液,其細(xì)胞成活率相對較低,而且細(xì)胞計數(shù)的方法也會給結(jié)果造成一定偏差,因此我們把標(biāo)準(zhǔn)定在50%。

 

2. 建好的文庫送給測序公司上機(jī)前,文庫質(zhì)檢達(dá)不到測序公司的合格標(biāo)準(zhǔn)怎么辦?

答:測序公司出于免責(zé)的考慮,對客戶自建的文庫質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)會比較嚴(yán)格,因此有可能我們庫檢沒問題的樣品測序公司會判定為不合格。請把測序公司的文庫質(zhì)檢結(jié)果發(fā)送劉元和牛松,我們根據(jù)質(zhì)檢結(jié)果判定是否應(yīng)承擔(dān)測序上機(jī)風(fēng)險。

 

3. 如果實驗失敗了,貴公司如何賠償?

答:兩種情況,一是如果因10x芯片或試劑導(dǎo)致實驗失敗,我們負(fù)責(zé)聯(lián)系廠家索賠,服務(wù)項目就更換試劑耗材重新做實驗。二是客戶細(xì)胞樣品合格、非風(fēng)險上機(jī)情況下建庫失敗,就不收取費用。實驗過程中的問題,我們和客戶應(yīng)本著互信原則協(xié)商解決,實驗失敗我們不對客戶細(xì)胞樣品進(jìn)行賠償。


4. 除了利用10x Genomics的Cell Ranger進(jìn)行的標(biāo)準(zhǔn)分析外,貴公司還能提供哪些分析?

答: 基本分析 

 ⑴ 提取測序序列 將bcl文件轉(zhuǎn)化為fastq,生成后期的樣本index序列文件,UMI序列及MRNA序列。

 ⑵ 序列比對注釋 將序列比對到相應(yīng)的參考基因組的基因區(qū)域。

 ⑶ 按照細(xì)胞和基因組信息統(tǒng)計UMI,barcode信息,計算細(xì)胞和基因表達(dá)矩陣。

   其他高級分析

 ⑴ t-SNE降維分析及聚類:利用T分布隨機(jī)相鄰嵌入法(t-SNE)對數(shù)據(jù)降維處理,基于2維數(shù)據(jù)展示。利用聚類算法對細(xì)胞進(jìn)行聚類分析,聚類后的細(xì)胞群體之間進(jìn)行差異表達(dá)分析。

 ⑵ 基因的富集分析:差異基因進(jìn)行后期的基因功能分析(GO和Pathway)。


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